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夫拉平度(Alvocidib)
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产品描述

Flavopiridol (Alvocidib)ATP竞争性抑制CDKs,包括CDK1 CDK2 CDK4CDK6IC50约为40 nM。作用于CDK1 2 4 6比作用于CDK7选择性强7.5倍。Flavopiridol最初被发现能抑制EGFRPKAPhase 1/2

靶点

CDK1 [1]

CDK2 [1]

CDK4 [1]

CDK6 [1]

CDK7 [1]

 

IC50

40 nM

40 nM

40 nM

40 nM

300 nM

 

体外研究

作为CDK广谱抑制剂,Flavopiridol可以抑制细胞周期进展,使其停在G1期或G2期。0.3 μM Flavopiridol作用于MCF-7MDA-MB-468细胞,通过抑制CDK4CDK2激酶活性,而诱导细胞周期停在G1 期。[4] Flavopiridol 作用于无关激酶,如MAP, PAK, PKC,  EGFR,活性低很多,IC50 >14 μMFlavopiridol 显著抑制HCT116, A2780, PC3,  Mia PaCa-2 细胞集落生长,IC50分别为 13 nM, 15 nM, 10 nM,  36 nM[1] Flavopiridol作用于多种肿瘤细胞系,具有细胞毒性,IC50为作用于LNCAP  16 nM 到作用于 K562130 nM[5]Flavopiridol也有效抑制糖原合成激酶-3(GSK-3) 的活性,IC50 280 nm[2]与其他CDKs相比, Flavopiridol抑制CDK7活性时效果稍弱,IC50875 nM Flavopiridol (0.5 μM) 抑制pSer807/811 Rb pThr199 NPM,而在pThr821 Rb上观察到轻微变化。Flavopiridol也降低全部RNA聚合酶 II 水平 RNA聚合酶 IICTD重复序列在 Ser2 Ser5位点磷酸化。[3]

体内研究

Flavopiridol7.5 mg/kg剂量处理P388 小鼠白血病,持续7天,具有轻微抗癌活性,导致%T/C值为110,且有效作用于皮下抑制人A2780卵巢癌的裸鼠,细胞对数杀灭(LCK)1.5 [5] Flavopiridol 1-2.5 mg/kg 剂量处理小鼠,持续10天,通过抑制滑膜增生和关节损伤,而显著抑制胶原性关节炎,这种作用存在剂量依赖性,然而抗II型胶原(CII) 抗体的血清浓度,和II型胶原对应的增殖维持不变。[6]

特征

Flavopiridol是第一个应用于人临床实验的细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂。


推荐的实验操作(此推荐来自于公开的文献所以美仑并不保证其有效性)

激酶实验: [1] [2] [3]

CDK 激酶实验

CDK1/cyclin B1 激酶实验中激酶反应包含100 ng表达 GST-CDK1/cyclin B1()复合体的 杆状病毒, 1 μg 组蛋白 HI, 0.2 μCi [γ-33P]ATP, 25 μM ATP溶于 50 μL 激酶buffer (50 mM Tris, pH 8.0, 10 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 0.5 mM DTT)CDK2/cyclin E 激酶实验中激酶反应包含5 ng表达GST-CDK2/cyclin E ()复合体的杆状病毒, 0.5 μg GST-RB 融合蛋白(成视网膜细胞瘤蛋白776-928 氨基酸), 0.2 μCi [γ-33P]ATP, 25 μM ATP溶于50 μL 激酶buffer (50 mM Hepes, pH 8.0, 10 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 2 mM DTT)CDK4/cyclin D1激酶实验中激酶反应含150 ng 表达GST-CDK4/cyclin D1 ()的杆状病毒, 280 ng Stag-cyclin D1, 0.5 μg GST-RB 融合蛋白(成视网膜细胞瘤蛋白776-928 氨基酸), 0.2 μCi [γ-33P]ATP, 25 μM ATP 溶于50 μL激酶 buffer (50 mM Hepes, pH 8.0, 10 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 2 mM DTT)30oC下, CDK1 CDK2反应温育45分钟,CDK4反应温育1小时,加入终浓度为15%的冰冻三氯乙酸(TCA) 终止反应。 使用Filtermate通用收集器,收集TCA沉淀物转移到GF/C 非过滤板上, 使用TopCount 96孔液体闪烁计数器测量过滤数。Flavopiridol溶于 10 mM二甲基甲酰胺(DMF) 中,测定六种浓度,每种重复测三次。实验中DMF终浓度为 2%。通过回归曲线分析获得IC50值,变异系数为 16%。测定Flavopiridol作用于 CDK6的活性进行过滤-结合实验。 反应混合物按如下结合: 2 μL CDK6 (0.7 mg/μL), 5 μL 组蛋白 H1 (6 mg/mL), 14 μL 激酶 buffer (60 mM β-甘油磷酸, 30 mM p-磷酸硝基苯酯, 25 mM MOPS (pH 7.0), 5 mM EGTA, 15 mM MgCl2, 1 mM DTT, 0.1 mM 钒酸钠), 50% DMSO中稀释的 3 μL 浓度不断增长的Flavopiridol ,及6 μL 33P-ATP (1 mCi/mL),非放射性 ATP,浓度为90 μM(终浓度为15 μM)。加入33P-ATP开始反应。 反应在30oC下温育20分钟。25 μL等分的上清液点样到Whatman P81 磷酸纤维素膜上。使用1% 磷酸溶液冲洗过滤器5次。 1 mL闪烁液存在时测定湿过滤器。使用 50 nM 重组Cdk9/cyclin T 50 mM HEPES pH 7.5, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT, 3 μM Na3VO4, 150 μM RNA 聚合酶CDT 肽和80 μM ATP中测定Cdk9活性。在相同buffer中使用37 nM纯化激酶,在200 μM ATP 存在时,10 μM 髓鞘蛋白(MBP)作为底物,进行Cdk7检测实验。使用强阴离子交换剂-为基础的检测实验或闪烁接近实验测定Flavopiridol 作用于CDK9CDK7的效果。通过剂量反应曲线计算IC50值。

细胞试验: [5]

细胞系

MCF-7, LNCAP, PC3, HCT116, CACO-2, A549, HL60, K562, 等等

浓度

溶于DMSO,终浓度为 ~10 μM

处理时间

72小时

方法

使用不同浓度 Flavopiridol 处理细胞72小时,加入四唑染料,MTS和吩嗪硫酸甲酯。小时后,492 nm处测定吸光值,与存活细胞数成比例。结果表示为IC50值。为了分析细胞周期,细胞在仲甲醛和乙醇中混合,冲洗,然后再悬浮在TdT 酶和 FITC-dUTP染色液中,再冲洗,使用PI染色,随后进行RNA酶处理,最后使用流式细胞仪分析。

动物实验: [5]

动物模型

腹腔注射P388 腹水白血病细胞的雌性Balb/c×DBA/2J F1小鼠,皮下移植A2780, Br-cycE, A431细胞的Balb/c nu/nu裸鼠

配制

溶于Cremophor/乙醇 (50:50) ,然后在水中稀释

剂量

~7.5 mg/kg/day

给药处理

腹腔注射


不同实验动物依据体表面积的等效剂量转换表(数据来源于FDA指南)

  小鼠 大鼠 豚鼠 仓鼠
重量 (kg) 0.02 0.15 1.8 0.4 0.08 10
体表面积 (m2) 0.007 0.025 0.15 0.05 0.02 0.5
Km 系数 3 6 12 8 5 20
动物A (mg/kg) = 动物B (mg/kg) ×  动物B的Km系数
动物A的Km系数

例如,依据体表面积折算法,将白藜芦醇用于小鼠的剂量22.4 mg/kg 换算成大鼠的剂量,需要将22.4 mg/kg 乘以小鼠的Km系数(3),再除以大鼠的Km系数(6),得到白藜芦醇用于大鼠的等效剂量为11.2 mg/kg。

大鼠剂量 (mg/kg) = 小鼠剂量 (22.4 mg/kg) ×  小鼠的Km系数(3)  = 11.2 mg/kg
大鼠的Km系数(6)

参考文献

[1] Kim KS, et al. J Med Chem, 2000, 43(22), 4126-4134.
[2] Lu H, et al. J Med Chem, 2005, 48(3), 737-743.

[3] Montagnoli A, et al. Nat Chem Biol, 2008, 4(6), 357-365.

[4] Carlson BA, et al. Cancer Res, 1996, 56(13), 2973-2978.

我司所售出产品仅供于科研研究用途(非临床科研研究),每次销售产品行为都适用于我司网上所列明的通用销售条款。


CAS 号:146426-40-6
英文名字:Flavopiridol
质量标准:>98%,CDK抑制剂
分子式:C21H20ClNO5
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摩尔浓度计算公式:质量 (g) = 浓度 (mol/L) x 体积 (L) x 分子量 (g/mol)
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