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Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒
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产品描述

本试剂盒用于检测细胞凋亡早期的发生,其中Annexin V为胞内蛋白膜联蛋白家族成员,以钙离子依赖的方式选择性与磷脂酰丝氨酸(PS)结合。

PS正常分布在细胞膜内侧,即与细胞浆相邻的一侧。在细胞发生凋亡的早期,不同类型的细胞都会把PS外翻到细胞膜外侧。用带有FITC标记的Annexin V,即Annexin V-FITC,就可以通过流式细胞仪或荧光显微镜检测到PS的外翻这一细胞凋亡的重要特征。

碘化丙啶(Propidium Iodide, PI)是一种可对DNA染色的细胞核染色试剂,在嵌入DNA后释放红色荧光。PI不能穿透完整的细胞膜,但可以穿透坏死细胞或凋亡晚期丧失细胞膜完整性的细胞。因此,将Annexin V与PI联合使用时,PI被排除在活细胞(Annexin V-/PI-)和早期凋亡细胞(Annexin V+/PI-)外,而晚期凋亡细胞和坏死细胞同时被FITC和PI结合染色呈现双阳性(Annexin V+/PI+)。

FITC最大吸收波长为490nm,激发波长为525nm,PI-DNA复合物的最大吸收和发射波长分别为535nm和615nm。 
 
实验数据



图1. 在凋亡激活剂2(MB4124)孵育C6细胞(大鼠神经胶质瘤细胞)1.5小时后,使用我公司Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒检测染色效果图。仅被绿色荧光染色的为凋亡前期细胞,被绿色和红色双染的是凋亡晚期或坏死细胞。

 


图2. 使用我公司Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒染色后流式细胞仪检测效果图。A549细胞(人非小细胞肺癌细胞)用100μM凋亡激活剂2(MB4124)作用5小时后,未经染色(A)、仅用本试剂盒中的PI进行染色(B)、仅用本试剂盒中的Annexin V-FITC进行染色(C)、用本试剂盒中的Annexin V-FITC和PI进行双染(D)。从图中可以看出,未经染色的是双阴性细胞(A),仅PI染色后出现了预期的PI染色阳性的细胞,仅Annexin V-FITC染色出现了预期的Annexin V-FITC染色阳性的细胞,Annexin V-FITC和PI双染出现了预期的仅Annexin V-FITC染色阳性的早期凋亡细胞和双阳性的晚期凋亡细胞。出现的非预期的细胞点完全在许可的误差范围内。实测数据可能会因细胞类型、细胞凋亡情况、检测仪器等的不同而存在差异,图中数据仅供参考。


操作步骤

1. 样品染色

1) 将Binding Buffer(10×)稀释成1×Binding buffer工作液备用(1ml Binding Buffer(10×)需加入9ml无菌去离子水)。

2) 对于悬浮细胞,500-1000g离心5min收集细胞。

对于贴壁细胞,要用不含EDTA的胰酶消化细胞,胰酶消化时间不宜过长或过短,最好是在轻轻吹打可以使贴壁细胞吹打下来时,加入细胞培养液,将细胞轻轻吹打下来,转移到离心管内,500-1000g离心5min收集细胞。

3) 收集细胞后,加入预冷PBS溶液轻摇或用移液器轻柔吹打洗涤,离心收集细胞,共洗涤两次。

4) 在细胞沉淀中加入1×Binding buffer工作液,重悬细胞,使细胞浓度达到1×106 cell/ml。

5) 吸取100μl细胞悬液(细胞总数为1×105 cell)至一新管中,加入5μl Annexin V-FITC和5-10 μl PI,轻轻混匀,室温避光孵育15min。

2. 样品检测

1) 流式细胞仪检测:

染色孵育后,每管加入400μl 1×Binding Buffer工作液,混匀后使用流式细胞仪检测(1小时内检测)。

建议设置经凋亡诱导的正常细胞、PI单染和Annexin V-FITC单染3个对照组,正常细胞组可作为荧光补偿调节去除光谱重叠和设定十字门的位置。结果可用CellQuest等软件进行分析,绘制双色散点图(two-color dot plot),FITC为横坐标,PI为纵坐标。Annexin V-FITC和PI联合使用时,活细胞仅有很低强度的背景荧光,早期凋亡细胞仅有较强的绿色荧光,晚期凋亡细胞有绿色和红色双重荧光。

2) 荧光显微镜检测:

染色孵育后涂片,显微镜下观察。使用荧光显微镜上的蓝光和绿光通道分别观察FITC和PI。被Annexin V-FITC结合的细胞显示浆膜上有绿色光环。丧失细胞膜完整性的细胞,细胞核显示红色,膜上有绿色光环。


保存条件

2-8℃避光保存,一年有效。Annexin V-FITC不可冷冻。


注意事项

1. 可立式离心管内试剂在开盖前请短暂离心,将盖内壁上的液体甩至管底,避免开盖时液体洒落。

2. Annexin V-FITC和碘化丙啶(PI)是光敏物质,在保存与操作时请注意避光。

3. 在细胞洗涤的最后一步,请尽量将上清弃净,以免PBS残留影响实验结果。

4. 为获得准确试验结果,建议样品在Annexin V-FITC染色后1小时内进行分析。

5. 为了您的安全和健康,请穿戴实验防护服、手套、口罩等必要的防护装备。

我司所售出产品仅供于科研研究用途(非临床科研研究),每次销售产品行为都适用于我司网上所列明的通用销售条款。

英文名字:Annexin V-FITC/PI Apoptosis Detection Kit
质量标准:Meilunbio
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摩尔浓度计算公式:质量 (g) = 浓度 (mol/L) x 体积 (L) x 分子量 (g/mol)
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