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五种筛选重组克隆的方法
2015-03-31  来源:美仑生物 技术部


筛选重组克隆是整个克隆流程的最后一步。在这之前已经将DNA片段连接入所选择的载体,并将重组载体转化入大肠杆菌E.coli细胞。转化的细胞被涂布于平板上,过夜培养后会生成大量的菌落。然而并不是生成的所有菌落都是正确的重组克隆,所以在宣布克隆成功之前,必须从中筛选出阳性克隆。下面总结的是5种常用的阳性克隆筛选方法。


1. 蓝白斑筛选

蓝白斑筛选是检验是否成功克隆的筛选方法之一。在这种方法中,片段被克隆入含有lacΖα序列的载体中。lacΖα序列编码的α-肽是β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)的功能单位。多克隆位点(MCS)位于lacΖα序列中。该质粒必须转化一种特殊的大肠杆菌菌体,即具有lacΖΔΜ15 突变的大肠杆菌。空载体因为α-肽(β-半乳糖苷酶)保留完整,筛选平板中的X-gal(乳糖类似物)会被β-半乳糖苷酶水解,生成蓝色物质(5,5'-dibromo-4,4'-dichloro-indigo),故会产生蓝色菌落。如果载体含有插入片段,将会影响lacΖα序列,α-肽的合成受到影响,进而X-gal不能被水解。因此,如果DNA片段已经插入载体,产生的菌落将是白色菌落。下一步可用其它方法来进一步进行验证。


2. 阳性筛选载体

简化筛选过程的一种有效方法是使用阳性筛选载体。阳性筛选载体能条件性地表达一种致死基因,比如表达一种限制性内切酶,酶解掉宿主细菌的基因组DNA。当DNA片段插入到克隆位点后,致死基因的合成受阻。因此,只有携带重组质粒的细菌细胞才能生长。此方法大大节约了时间和成本,重组效率>99%。Thermo Scientific CloneJET PCR Cloning Kit便是使用这种阳性克隆筛选方法。


3. 限制性酶切检验

限制性酶切同样也能用于检验片段是否插入。首先,使用质粒小提试剂盒,如Thermo Scientific GeneJET Plasmid Miniprep Kit,从过夜培养的菌液中分离提取质粒DNA。使用我们的REsearch限制性位点查找工具可以查找已知序列上的限制性酶切位点。选择出可以鉴定片段是否插入的合适酶切位点,之后使用限制性内切酶酶切经纯化的质粒DNA。如需快速进行酶切,推荐使用 Thermo Scientific FastDigest快速限制性内切酶,只需5分钟便可完全酶切。酶切后进行凝胶电泳,检验酶切后的片段是否符合预期大小。


4. 菌落PCR

DNA片段是否插入同样可以用菌落PCR方法来鉴定。检测插入片段的PCR引物可以是插入片段特异性的引物、载体特异性的引物、或者二者都特异性的引物。为了确定插入的方向,推荐将载体特异性的引物和插入片段特异性的引物结合使用。菌落PCR筛选适用于筛选3 kb以下的插入片段。单个菌落可以直接加入到PCR预混液(如Thermo Scientific PCR reagents)中扩增。菌落剩余部分培养于含相应抗生素的培养平板或LB培养基中,以便用于下游实验。


5. 测序

检测重组克隆最精确的方法是测序。首先从过夜培养的菌液中分离质粒DNA。使用合适的测序引物,通过Sanger测序鉴定片段是否插入。测序需覆盖整个插入序列,以便检测整个插入片段的正确性。 

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