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色谱峰保留时间变化常见原因和解决方法
2015-03-02  来源:大连美仑生物技术有限公司

 确定色谱峰保留时间不稳定的原因首先需要找出变化的模式。

保留时间在多次进样间随机变化

建议首先检查泵和溶剂混合装置。校验泵是否工作正常,可以用量筒和秒表来测量流速。校验流动相组成没有变化,可以在流动相中加入跟踪剂来观察基线的变化。如果流动相组成是稳定的,基线也应该很稳定。如果流动相组成有变化,你会观察到基线的相应变化。举例说明,如果你使用反相条件,UV检测器,可以在有机相溶剂中加入0.1%的丙酮,监测254 nm下的基线变化。另一种方法也可以,你需要人工配制流动相,然后通过溶剂混合装置。如果保留时间的变化消失了,问题就出在溶剂混合装置上。

一天之内的进样保留时间一致,但是不同天数之间的保留时间变化

这种情况下,仪器本身不太可能有问题。保留时间变化最有可能的原因是流动相组成的变化。在反相色谱中,保留因子k和流动相中有机溶剂的体积含量成指数关系。根据经验,如果有机溶剂含量误差1%,那么保留时间的变化在5%到15%之间,典型情况在10%左右。建议仔细称量有机溶剂,最好的配制流动相方法是用质量称量代替体积称量。

此外,流动相如何脱气也可能导致保留时间的变化。最好的脱气方法是使用真空超声脱气大约一分钟左右,这会最大程度的减少溶剂蒸汽的挥发。另一个方法是用氦气流喷射,在流动相被氦气平衡后,氦气流必须被关闭,否则氦气会带走溶剂蒸汽,溶剂的组成会由于蒸发而发生变化。

如果样品组成是离子状态或者离子化的,那么控制流动相的pH值非常重要。小到0.1单位的pH变化会导致保留时间漂移10%左右。所以准确测量pH值并保证pH仪被很好地的校准。在反相色谱中,随着流动相pH值的升高,酸保留时间会减少,碱的保留时间会增加。

化学老师常说“缓冲溶液之所以被称为缓冲溶液,因为它是用来缓冲pH 值的。如果它做不到,那就不能称之为缓冲溶液”。举个例子,醋酸铵溶液只是醋酸铵溶液,醋酸缓冲液包括醋酸根离子和醋酸,如果它们的当量相同,此时的pH值就是醋酸缓冲溶液的pK值4.75。缓冲溶液在它的pK值上有最大的缓冲能力。

色谱峰保留时间朝同一个方向漂移

如果所有色谱峰的保留时间都朝同一个方向漂移,很可能是温度原因所致。根据经验,每℃的变化导致保留时间变化大约1%到2%左右。在通常情况下没有什么问题,但是在许多地方空调和暖气在周末的时候会关闭,然后会出现样品在周末的保留时间会和平时不一样。使用柱温箱可以很好的避免这个问题。

其它原因

在反相色谱中,如果分析离子或离子化的样品,保留时间会受到缓冲溶液的离子强度的影响,但是影响会很小,通常可以忽略不计。典型的状况是缓冲液的摩尔数改变20%,保留时间变化约1%。由于缓冲液组分通常是称量的,那么大的误差是不会发生的。

在离子对色谱中,离子对试剂的浓度会影响离子化样品的保留。与离子对试剂电荷相反的分析物保留时间会增加,相同电荷的保留时间减少,中性化合物基本不受影响。在低浓度下,例如小于5 mM/L,样品组分保留时间的变化受与离子对试剂浓度影响,与离子对试剂的浓度成正比。在高浓度离子对试剂下,例如10 mM/L左右,填料表面被离子对试剂饱和,那么试剂浓度的改变不会对样品保留时间有明显的影响。这是在方法开发时需要考虑的问题。如果你需要把方法做到不受任一个变量的影响,那就应该那么做。

在正相色谱中,保留时间对流动相中极性组分的浓度非常敏感。这个组分无论是你需要还是不需要的,通常是指水。水含量的变化会导致保留时间的变化,比较好的解决办法是使用半饱和的非极性溶剂,例如正己烷或二氯甲烷。为了达到半饱和状态,通常需要往一定体积的溶剂中加一些水,搅拌一段时间使其饱和,然后把它和等体积的“干燥”溶剂混合。通过这个过程,理论上能让你在使用含水非极性溶剂时得到比较好的重现性,避免保留时间的漂移。

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