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Western Blot的问题总结及经验
2015-02-26  来源:美仑生物 技术部

 总结了一些关于Western Blot的一些经验问题,与大家分享

1. 在western实验中,通常有人采用TBS,有人采用PBS,能否有人解释一下二者在使用中的区别?
选择合适的缓冲液对于维持一定PH值下蛋白质的稳定及保证实验的重复性是很重要的。PBS的缓冲能力强于TBS(因为混合缓冲液在一定的离子强度下常常具有更宽的缓冲范围),TBSPH7.0以下缓冲能力较弱(不过PBS易污染)。但我们常常要根据我们实验目的选用合适的缓冲液,如在蛋白纯化中进行阴离子交换层析,阳离子缓冲液首选TBS;阳离子交换层析时,阴离子缓冲液则首选PBS
western blot中使用TBSPBS均可,只是要根据需要选择合适的浓度。


2. 没有注明可以用来做western blot的一抗,可以用来做western blot吗?
不一定,因为有的抗体是识别线性表位的,有的是识别构象型表位的,识别构象型表位的抗体不能用于western blotting,因为在western blotting中抗体识别的是完全变性的蛋白质抗原,而蛋白质抗原的构象型表位变性时被破坏。


3. 做western每次只加一种一抗,可以同时加两种或者多种一抗的吗?
最好还是不要同时加两种一抗。因为如果结果里面有非特异信号的话,就说不清楚了。做Western在同一张膜上检测目的蛋白和内对照,也是先上目的蛋白的一抗、二抗,ECL显色、压片、洗片;漂洗以后,再上内对照的一抗、二抗,ECL显色、压片、洗片。


4. western blot 使用的膜哪种最好啊,PVDF好还是NC膜,能介绍一下膜的选择吗?
PVDF膜价格较贵,可重复使用,特别适合蛋白印迹,结合能力较强,但价格比较昂贵。 NC膜价格比较便宜,应用较广,结合牢固性差一些,韧性也不如PVDF,不能重复使用,但蛋白吸附容量高,亲水性较好。 都可以用丽春红染色。具体使用还要参考相关文献。


5. 为什么出现了多条带,每个加样槽中都出现了多条带,而且好象都很有规律,为什么?是封闭时间不够吗?做WESTERN必须要内参吗?
一抗、或二抗抗体浓度太高,多克隆抗体本身的非特异性反应,抗体的特异性不强,目的蛋白经过处理后发生变化,而内参的条带基本均匀一致.这样才有说服力,表明的确是处理因素造成目的蛋白的变化而不是加样误差或认为的造成目的条带浓度的变化.所以严格意义上说,内参是必须做的。


6. western用的一抗,单抗好些还是用多抗好些?购买一抗时发现单抗(用于western)比多抗(用于western和ELISA)要便宜不少,用于western的抗体和用于ELISA的抗体有什么不同的要求?
作为western来讲,理论上单抗比多抗的特异性要好,但单抗种类较少一般价格偏高,所以一般来说多抗足够了。用于western的抗体和用于ELISA的抗体,一般来说用于western的抗体识别的是氨基酸序列特异性;而可用于ELISA的抗体则要看抗原种类,有些是识别氨基酸序列特异性,有些是识别构像特异性。所以一般根据抗体说明书来确定。
做免疫印迹时选择抗体主要应考虑两个问题,一是所选抗体是否能识别凝胶电泳后转印至膜上的变性蛋白,另一个是所选抗体是否会引起交叉反应条带。


7. 半干转是否要求膜,滤纸,胶同样大小?因为胶大小不一定规则,膜和滤纸会大一点,那样会不会短路?什么是短路?如何控制和发现短路呢?
可以相等,但是如果纸、膜比凝胶大就比较容易形成短路了,上下两层虑纸也不能因过大而相互接触,这样同样会短路,电流不会通过胶和虑纸。转移前和转移过程中看看电压就行,正常的半干是慢慢变高的, 最后结束时一般是开始的1.5-3倍都是正常的。一般Buffer和滤纸选的对就不会短路。


8. Western Blot哪种染色好?
1) 阴离子染料是较常用的,特别是氨基黑,脱色快,背景低检测极限可达到1.5μg,考马斯亮蓝虽然与氨基黑有相同的灵敏度,但脱色慢,背景高。丽春红S和快绿在检测后容易从蛋白质中除去 ,以便进行随后的氨基酸分析。缺点是:溶剂系统的甲醇会引起硝化纤维素膜的 皱缩或破坏。不能用语正电贺的膜。灵敏度低。
2) 胶体金,灵敏度高,检测范围可到pg级,但染色比稳定。
3) 生物素化灵敏度位于12之间,可用于任何一种膜。


9. 不能很好地将大分子量蛋白转移到膜上, 转移效率低怎么样解决?
可以考虑:转移缓冲液中加入20%甲醇(是指终浓度)(优化的转移缓冲液,可以参考《蛋白质技术手册》),因为甲醇可降低蛋白质洗脱效率,但可增加蛋白质和NC膜的结合能力,甲醇可以防止凝胶变形,甲醇对高分子量蛋白质可延长转移时间;转移缓冲液加入终浓度0.1%SDS,也是为了增加转移效率;用优质的转移膜,或使用小孔径的NC膜(0.2微米);使用戊二醛交联;低浓度胶,如低至6%。太大时还可以考虑用琼脂糖胶;提高转移电压/电流;增加转移时间。


10. DAB显色、碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶显色原理是什么?
DAB显色在辣根过氧化酶的作用能形成一种灰褐色的终末产物,该产物难溶于醇和其他有机溶剂,DAB的氧化还能引起聚合作用,导致与四氧化锇反应而增加其染色强度和电子密度。碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶显色中,酶将奈酚磷酸(底物)水解成酚类和磷酸。酚和无色的重氮盐(显色原)结合而产生有色的、不溶性偶氮染料。


11. 酶显色与荧光显色之间,各自的优缺点是什么?
免疫酶技术就是用酶(如辣根过氧化物酶)标记已知抗体(或抗原),然后与组织标本在一定条件下反应,如果组织中含有相应抗原(或抗体),抗原抗体相互结合形成的复合物中所带酶分子遇到底物时,能催化底物水解、氧化或还原,产生显色反应,这样就可以识别出标本抗原(抗体)分布的位置和性质,通过图像分析并可达到定量的目的。
免疫荧光技术虽已广泛应用于免疫学的研究与诊断,但是荧光抗体染色标本不能长期保存,对组织细胞的细微结构分辨不清,免疫酶技术则能克服上述不足,标记免疫酶技术的敏感性更优于免疫荧光法,对石蜡切片标本尤为适用,为免疫病理研究开辟了一条新途径,酶显色产物具有较高的电子密度,经过适当处理还可以进行免疫电镜观察,免疫酶组化技术分为酶标记法与非标记抗体技术,前者是将酶通过交联剂结合在抗体分子上,形成酶标记抗体。后者是将酶作为抗原与相应的特异性抗体连接进行的免疫反应,称为非标记抗体酶技术。

12. 膜上一片空白,为什么呢?

A:导致这种结果的因素很多。

胶和膜放反了:如果在转印的过程中,胶和膜的位置颠倒了,那么蛋白就从胶上转移到缓冲液中,而不会到达膜上。对于标准的转印,凝胶应靠近负极,而膜对应正极。

转膜效率低:转膜效率受多种因素影响,包括蛋白的大小、凝胶中丙烯酰胺的百分比、电场强度、转印时间和缓冲液的PH值。一般来说,蛋白越大,转移的越慢。转移大蛋白最好的方法是用高的电场强度。而小蛋白长时间处于高电场强度下可能会传出转印膜。避免这个问题的方法是用0.2μm孔径的PVDF膜进行转印。如果蛋白的等电点接近缓冲液的pH值,那么这个蛋白携带的电荷很少,在电场中页几乎不移动。如果你的目的蛋白是强碱性的,那么你可以用碳酸盐(pH9.9)、CAPSpH11)及酸性缓冲液。

在转印之后,你可以通过染胶或第二块膜来判断转印效率。为了帮助你直接监控转印效率,Bio-Rad也提供了多种预染Marker,它们在电泳以及转膜之后可直接观察到。

试剂放置太久或存放条件不正确:抗体会慢慢降解,如果反复冻融的话,它会快速降解。底物应储存在-20℃。

抗体不纯或滴度太低:一抗的浓度差异很大,应该根据经验来决定一抗的稀释度。过犹不及,太多的抗体页会阻碍抗原与抗体的结合。一般的原则是以1100-1:1000来稀释血清或组织培养上清,以11000-110000来稀释腹水或超免疫动物的血清。Bio-Rad的印迹级别的二抗稀释度是13000

酶失活了:叠氮钠是辣根过氧化物酶的抑制剂。不要再HRP显色的Western blot中使用任何含叠氮钠的试剂。叠氮钠可以用于碱性磷酸酶结合的抗体中,而无副作用。另外,只能使用蒸馏的去离子水。

使用Tween-20洗涤:Tween-20(吐温-20)可能会干扰某些抗体-抗体相互作用,或洗去PVDF膜上的目的蛋白。尽管在洗涤时它的终浓度只有0.05%-0.1%,但仍可能会影响结合。因此除了封闭之后的第一次洗涤,其他洗涤过程中都不使用Tween-20,不过,这可能会使背景升高。

检测系统缺乏足够的灵敏度:确保蛋白的上样量在检测系统的灵敏度范围内:

辣根过氧化物酶 500pg/band

碱性磷酸酶 100pg/band

增强的碱性磷酸酶 5pg/band

胶体金 100pg/band

增强的胶体金 10pg/band

Immun-Star化学发光 10pg/band

13. Western blot总是背景过高,如何解决?

应该是多因素引起的:封闭不完全、显色过度、洗涤不充分、转移缓冲液或设备有污染、抗体稀释度不对或抗体不纯。

封闭不完全:一抗或二抗只要结合到膜上,就会显色。为了避免非特异性的结合,应用封闭液孵育膜,使所有的空白位点都被封闭蛋白占有。NC膜推荐的封闭液是3%的明胶。在室温孵育1小时。明胶不能再4℃孵育,因为会凝结。如果想在低温封闭的话,可以用3%BSAPVDF膜推荐的封闭液是5%的脱脂奶粉。脱脂奶粉不能与Bio-Rad生物素化的蛋白标准一起使用。脱脂奶粉浓度过高也可能会产生背景!

显色过度:显色时间的长短取决于蛋白条带的数目以及你想要的灵敏度。如果膜在显色液中放置太久,背景就会偏高。应当在蛋白条带清晰可见,而背景几乎没有或很少时,将膜及时取出。

转移缓冲液或设备污染:使用清洁剂将转印槽内外彻底清洗干净。海绵垫也一定要认真清洗。脏的海绵垫通常是污染的最主要原因。另外 ,每次转膜时的缓冲液都要是新鲜配制的。

抗体稀释度不正确:一抗的稀释度应根据抗体来源和经验来决定。一般来说,以1100-1:1000来稀释血清或组织培养上清,以11000-110000来稀释腹水或超免疫动物的血清。Bio-Rad的印迹级别的二抗稀释度是13000。抗体稀释度不够,会产生非特异性的结合,带来高背景。

二抗不纯:没有交叉吸附过的二抗可能会与膜上的其他蛋白相互作用,产生杂带。

14. 在转膜的过程中,缓冲液总是很热,该怎么办?

A: 如果缓冲液过热,它就会分解,产生更多的热量。这可是一个大问题。为了避免分解,一定要确保你的冷却设备没问题,使用的是推荐的缓冲液,而且不在过高的功率下转印。

足够的冷却的条件:在大部分情况下,都应当使用循环冷却水来进行冷却。在冷库中转印,或将转印槽放置在冰浴中都是不行的。因为大部分转印槽都是塑料做的,不能有效地散热。另外,由于胶附近的缓冲液通常是静止的,在转印过程中应搅动来维持循环。

缓冲液:转印缓冲液的离子浓度必须是已知的,来防止过热。如果离子浓度过高,电压就应该降低(恒流转印),如果是恒压转印的话,就会过热。

功率条件:转印过程中产生的热是与功率成正比的。功率是电压与电流的乘积。当缓冲液分解时,电阻下降。如果电压是恒定的,则电流上升。因此,功率上升,产生更多的热量。如果电流是恒定的,则电压和功率下降,使蛋白转移得更慢。下表就列出了推荐的缓冲液及转膜条件。

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