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双萤光素酶报告基因检测技术服务

 

萤光素酶报告基因系统广泛应用于真核生物基因表达和细胞生理学研究,包括受体活性、转录因子、细胞信号转导、mRNA加工和蛋白质折叠等。萤光素酶是理想的报告基因,因为哺乳动物细胞中不含内源性萤光素酶,一旦转录完成立刻就生成功能性的萤光素酶。单萤光素酶报告基因实验往往会受到各种实验条件的影响,而双萤光素酶报告基因通常被用来提高实验精确度,即在一个系统中同时表达和测量两个独立的报告基因。一般来说,实验组报告基因与具体实验条件的影响是相关的,而共同转染的内对照组报告基因则是用来充当校正参数,作为内参提供反应基线。将实验组的结果与内对照组的结果进行约化处理,可降低由细胞存活率或转染效率的差异而导致的结果波动,同时还可消除由取样体积、细胞裂解效率和仪器测定引起的实验误差。因此,双报告基因检测可以通过减少外部影响来获得更可靠的实验数据。

美仑双萤光素酶报告基因检测试剂盒(Meilunbio®Firefly&Renilla Luciferase Reporter Assay Kit)提供了一种有效的双报告基因检测方法,在同一个样品中先以萤光素(Luciferin)为底物来检测萤火虫萤光素酶(Firefly luciferase),后以腔肠素(Coelenterazine)为底物来检测海肾萤光素酶(Renilla luciferase),同时淬灭Firefly luciferase的萤光信号,实现双萤光素酶报告基因检测。

 

本公司现提供双萤光素酶报告基因检测技术服务具体内容如下:

 

 

 

 

一. 启动子活性研究

顺式作用元件(cis-acting element)存在于基因旁侧序列中能影响基因表达的序列。顺式作用元件包括启动子、增强子、调控序列和可诱导元件等,它们的作用是参与基因表达的调控。而转录因子则是一种具有特殊结构、行使调控基因表达功能的蛋白质分子,也称为反式作用因子。

检测药物或者转录因子对于靶基因启动子调控作用是双酶报告基因主要功能之一。将目的基因启动子区连接到Firefly luciferase序列,通过给药或者共表达转录因子后,报告基因表达的改变,来确定给药或者转录因子对靶基因启动子调控作用。

 

1. 检测药物处理对目的启动子活性的影响

材料:实验质粒pGL4.17[luc2/Neo] (E6721 Promega);对照质粒;pGL4.73[hRluc/SV40] (E6911 Promega);目的药物;目的细胞株

步骤:

1)药物选择、作用启动子以及目的细胞株都确认后,合成启动子序列;

2) 将启动子克隆至报告基因载体;

3) 将报告载体与内参质粒共转染293T细胞;

4) 多功能酶标仪检测报告基因表达水平

5) 数据分析,整理提交客户原始数据及实验报告

注:为了实验严谨性,根据实验需要可以添加突变组或者天然组作为对照

分组参考:一组实验包括(启动子;空载;启动子+给药;空载+给药),每组检测时各做3个复孔。给药梯度如果是5个浓度,那么一按照1000元/浓度加价。

 

客户需提供信息:

①目标启动子信息(名称、种属、基因序列等)

②所需药物名称及浓度梯度设计

提供给客户:

①质粒及其构建报告

②原始数据

③双荧光素酶检测报告

报价情况

美仑生物 7000/组+1000元/单个药物浓度;

服务周期3-5周

2.检测转录因子对目的启动子活性的影响

材料:实验质粒pGL4.17[luc2/Neo] (E6721 Promega);对照质粒;pGL4.73[hRluc/SV40] (E6911 Promega);转录因子过表达质粒;293T细胞株

步骤:

1) 靶点预测及确认后,直接合成启动子序列或者转录因子调控区序列;

2) 将上述合成的DNA片段克隆至报告基因载体;

3) 构建转录因子过表达载体;

4) 将报告载体和内参质粒以及转录因子过表达载体共转染293T细胞;

5) 多功能酶标仪检测报告基因表达水平

6) 数据分析,整理提交客户原始数据及实验报告

注:为了实验严谨性,根据实验需要可以添加突变组或者天然组作为对照。

分组参考:一组实验包括(启动子;空载;启动子+转录因子;空载+转录因子),每组检测时各做3个复孔。转录因子质粒构建需视难易程度另行收费。

 

客户需提供信息:

①目标启动子及转录因子相关信息(名称、种属、基因序列等)

提供给客户:

①质粒及其构建报告

②原始数据

③双荧光素酶检测报告

报价情况

美仑生物7000元/组+转录因子过表达载体合成费用(1000元+议价);

服务周期3-5周

二.  miRNA靶基因验证 (针对3’UTR元件)

  miRNA主要通过作用于靶基因的3’UTR起作用(降解或抑制翻译),将目的基因3’UTR(野生型和结合位点突变型)序列构建至载体中报告基因F-Luc的3’端,通过比较过表达miRNA后,报告基因表达的改变(萤光素酶的活性下降还是不变),来确定miRNA与靶基因3’UTR的作用位点。

目的:验证miRNA与靶基因3’UTR 是否发生调控作用。

材料:质粒pMIR-REPORT Luciferase基因3'UTR(Wt);pMIR-REPORT Luciferase-基因3'UTR(Mut);pRL-CMV(H321,Promega);293T细胞株

步骤:

1) 靶点预测及确认后,直接合成靶基因3’UTR序列或microRNA在靶基因3’UTR上的结合位点序列;

2) 将上述合成的DNA片段克隆至报告基因载体psiCHECK2 (C8021) or pmirGLO Dual-Luciferase miRNA Target Expression Vector (E1330);

3) 购买microRNA mimics;

4) 将报告载体与microRNA mimics共转染293T细胞;

5) 多功能酶标仪检测报告基因表达水平

6) 数据分析,整理提交客户原始数据及实验报告

注:为了实验严谨性,可加入靶基因3’UTR区microRNA预测结合区域的突变体作为对照,进一步说明问题。

客户需提供信息:

①靶基因名称

②靶基因种属

③调控因子相关信息

提供给客户:

①质粒及其构建报告

②原始数据

③双荧光素酶检测报告

技术路线简图

 

 

 

报价情况

美仑生物5500元/组(靶点)

服务周期3-5周

如何委托:

如果您需要委托我们开展相关服务,请直接联系我司0411-39217210或当地授权代理商,

并需要填写项目委托书,发至邮箱market1@meilune.com

双萤光素酶报告基因检测服务委托单 下载

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